Narozena v Praze, zemřela v Českých Budějovicích. Vlastním jménem Emilie Pavlína Kittlová. Umělecké jméno Ema Destinnová si zvolila z vděčnosti ke své učitelce.

Už v pěti letech se začala učit hře na housle. V letech 1892–1896 studovala zpěv ve škole M. Löwe-Destinnové a T. Löweho. Navštěvovala rovněž Dramatickou školu Národního divadla, kde byla žačkou O. Sklenářové-Malé. Již tehdy se začala zajímat o divadlo a přihlásila se k pohostinskému vystoupení s divadelním souborem K. Stockého, který od konce roku 1894 pořádal představení v Národním domě na Vinohradech. V roce 1897 předzpívala řediteli Národního divadla F. A. Šubertovi, ale byla odmítnuta. Brzy poté se pokoušela o přijetí v Drážďanech (Hofoper) a v Berlíně (Theater des Westens). V Berlíně však byla angažována k Dvorní opeře (Hofoper), kde vystoupila 19. 7. 1898 jako Santuzza v Mascagniho Sedláku kavalírovi, poprvé pod pseudonymem Destinnová. V roce 1901 hostovala v ND v titulní roli Bizetovy Carmen a Thomasovy Mignon, s větší odezvou u obecenstva než u hudební kritiky.

V roce 1901 byla pozvána do Bayreuthu zpívat Sentu (Bludný Holanďan). Podruhé hostovala v ND v roce 1903 v úloze Smetanovy Mařenky (Prodaná nevěsta) a opět v úloze Mignon. V dalších letech se stala proslulou sopranistkou obdivovanou významnými světovými osobnostmi, skladateli, dirigenty a zpěváky. V roce 1904 zpívala poprvé s E. Carusem v Londýně (Covent Garden), v roce 1906 se vytvořením titulní úlohy podílela na úspěchu berlínské premiéry Straussovy Salome. V roce 1908 vystupovala za řízení A. Toscaniniho v New Yorku.

Od ledna do září 1908 absolvovala v ND sérii 17 pohostinských vystoupení, při té příležitosti byla jmenována čestným členem ND "v ocenění velkých zásluh, které sobě o české umění operní jako vynikající umělkyně česká v cizině získala". Každé její vystoupení se pokládalo za kulturní událost mimořádného dosahu pro současnost i pro další rozvoj českého operního umění. Celkem Ema Destinnová hostovala v ND více než 80x, naposledy 20. 3. 1924. Měla-li její vystoupení v ND před válkou význam především kulturně společenský, nabývala za války funkce demonstrativně politické. Tím spíše, že se vědělo o jejím vlasteneckém postoji. Byla dána pod policejní dozor, který jí znemožnil plnit smluvní závazky s Metropolitní operou v New Yorku. V roce 1917 byla v ND vítána jako symbol národní a kulturní svobody: zpívala tehdy mj. Smetanovu Libuši a projevila se jako vlastenka neskrývaně protimonarchistického smýšlení. Po převratu v roce 1918 se snažila obnovit své dřívější mezinárodní postavení (v letech 1919–1921 trojí americké turné), ale stále více se zaměřovala na koncertní činnost a postupně se vzdávala uměleckého působení.

Rok před svou smrtí začala soukromě vyučovat zpěv. Svěžest a krásu svého hlasu si však uchovala až do konce života. Ještě v roce 1928 vystupovala v Londýně a v roce 1929 v Košicích v roli Mařenky. Věnovala se rovněž tvorbě básní, románů a dramat. Na její básnické texty, vydávané i v Německu, komponovali skladatelé písňové cykly (např. L. Blech). V roce 1908 byla ve Švandově divadle na Smíchově uvedena její hra Rahel, v roce 1928 složil K. Balling na její libreto operetu Anatol se žení. Po její smrti prohlásil R. Strauss, že odešla jedna z největších zpěvaček s jedním z nejkrásnějších hlasů.

Pochována je na Slavíně (56/14) v Praze.