Narozena v Radonicích u Prahy, zemřela v Praze. Vlastním jménem Milada Železná. Umělecké jméno Milada Matysová si zvolila na počest svého učitele a strýce Vojty Matyse. Herectví a recitaci studovala soukromě nejprve u Vojty Matyse, po jeho smrti roku 1922 začala docházet k Marii Hübnerové. Zásadní pro další vývoj a profesní dráhu tehdy sedmnáctileté Milady Matysové bylo setkání s F. X. Šaldou, který ji roku 1920 slyšel na univerzitě, jak pro studenty recituje Edgara Lee Masterse a americkou poezii ve volném verši. Šalda ji pro její mládí a cit vybral k recitaci Wolkra v Městském divadle na Vinohradech a roku 1926 pro cyklus Sociální poezie pro Klub moderních nakladatelů Kmen.

Roku 1929 si zahrála titulní ženskou roli v inscenaci Jiřího Frejky Romeo a Julie, jež byla uvedena v Moderním studiu. Téhož roku hostovala i v Národním divadle, kde ztělesnila Gvendolínu (Na čem záleží aneb Jak je důležité míti Filipa). Později získala krátkodobé angažmá v Městském divadle v Plzni (sezona 1930/1931), ve Švandově divadle v Praze (1932/1933), či v Novém avantgardním divadle v Unitarii (1933/1934). V letech 1935–1940 se stala členkou Českého divadla v Olomouci, kde hrála např. komisařku v Optimistické tragédii, trestankyni Káťu v dramatizaci Vzkříšení nebo Hedviku v Divoké kachně. Po roce 1940 opět hostovala v ND (Před západem slunce, 1942). V letech 1943–1944 hrála v Nezávislém divadle v Praze a v letech 1944–1945 získala angažmá v Brně, kde ztvárnila Eleonoru Duse v Appasionatě. Působila i v Divadle 5. května, kde hrála titulní postavu Anouilhovy Antigony (1946) ve stejnojmenné inscenaci Antonína Kurše. V letech 1948–1950 získala angažmá v Divadle Státního filmu a 1950–1963 v Divadle na Vinohradech, kde ukončila svou profesní dráhu.

Byla i filmovou herečkou – např. Harrachová ve snímku Z mého života (1955). Rokem 1939 začal dle korespondence vztah Milady Matysové s básníkem Ivanem Blatným. V roce 1948 básník emigroval do Anglie. Jejich vztah pak fungoval už jen korespondenčně.